一、 实验流程

1. 蛋白质提取

1.1 每个蛋白样品组织加入对应标记的1.5 ml离心管中，约100mg每个样品。在液氮中研磨完全至粉末状。加入200 μl的RIPA裂解液 （康为世纪强裂解液CW2333S；裂解液中加入PMSF，终浓度1 mM；加入Phosphatase Inhibitor Cocktail （康为试剂，CW2383），终浓度1X）。

1.2 样品在冰上静置30 min。15 min颠倒混匀一次。

1.3 样品离心，12,000 g 4 ℃离心20 min。

1.4 吸取上清溶液即为蛋白样品。（尽量避免吸取底层组织沉淀。）样品颜色为略微浅[敏感词]。

2. 蛋白质定量 （康为世纪 BCA Protein Assay kit）

2.1 稀释BSA标准品

采用梯度稀释方式，从高浓度逐级稀释。每个样品从前一个样品中吸取对应的体积。样品6混合均匀后吸出25 μl弃用，故所有样品均为25 μl。

2.2 准备样品 每个样品加入2.5 μl加入22.5 μl lysis buffer，混合均匀备用。每个样品做两个重复。

2.3 配置BCA工作液 BCA-A液与BCA-B液按1:50体积比配成工作液，充分混匀。

2.4 定量检测 样品及标准品中每管加入200 μl工作液，混合均匀。然后放到37℃水浴锅中反应30 min。反应结束后立即冷却终止反应。在3-5 min内检测每个样品和标准品562 nm吸光值。

2.5 根据BSA标准品检测结果绘制标准曲线，计算每个样品中的蛋白浓度。

3. Western Blotting 

3.1. 蛋白样品准备

每个样品的上样量为20 μg （具体样品WB条件见下表格），加入对应的5 X SDS （β-ME终浓度1%），用buffer补齐至10μl。95 ℃沸水浴中煮沸10 min。

3.2 SDS-PAGE胶制备 配置10%的分离胶和5%的浓缩胶，进行蛋白样品电泳。

3.3 电泳后进行转膜，封闭，一抗免疫 （一个目的蛋白/GAPDH内参），二抗免疫，显色过。具体流程见流程图。

4. 蛋白表达量定量分析

利用Image lab 对ECL化学发光显色后结果，转化成灰度图后，对信号强度进行相对定量分析。